První díl učebnice je rozčleněn do 5 hlavních kapitol, které jsou zaměřeny na teoretické aspekty HPLC a vzájemně se tematicky prolínají. V této části se autoři zabývají základními pojmy chromatografické separace, instrumentací v HPLC, chromatografickými separačními módy, stacionárními fázemi a současnými trendy v HPLC. Uvedené kapitoly přinášejí podrobnou a zároveň velmi názorně zpracovanou tématiku vhodnou jak pro vysokoškolské studenty, tak pro čtenáře bez hlubšího vzdělání v tomto oboru.

Druhý díl se zabývá praktickou částí HPLC, jmenovitě laboratorní praxí v oblasti HPLC, vývojem a optimalizací metody, přípravou vzorku k chromatografické analýze, vyhodnocováním výsledků, validací metod, kvalifikací HPLC systémů a řešením problémů v HPLC. Tato část je zaměřena ryze prakticky a najde uplatnění zejména u čtenářů pracujících v tomto oboru v oblasti průmyslu, farmacie, zemědělství i akademické sféry.

Obsah I. Dílu

1 HISTORIE A VÝVOJ KAPALINOVÉ CHROMATOGRAFIE

1.1         OD PRVNÍCH SEPARACÍ K VYSOKOÚČINNÉ KAPALINOVÉ CHROMATOGRAFII

1.2         VÝVOJ KAPALINOVÉ CHROMATOGRAFIE V NOVÉM MILÉNIU

2 ZÁKLADNÍ POJMY CHROMATOGRAFICKÉ SEPARACE

2.1         POPIS RETENCE V CHROMATOGRAFICKÉM SYSTÉMU

2.2         POPIS SELEKTIVITY V CHROMATOGRAFICKÉM SYSTÉMU

2.3         POPIS ÚČINNOSTI V CHROMATOGRAFICKÉM SYSTÉMU

                Tvar chromatografického píku

                Popis symetrie chromatografického píku

                Účinnost chromatografického systému

                Dynamická van Deemterova teorie

                Mimokolonové příspěvky k rozmývání eluční zóny

2.4         POPIS ROZLIŠENÍ

                Vliv jednotlivých parametrů rovnice rozlišení na chromatografickou separaci

2.5         PARAMETRY CHROMATOGRAFICKÉ SEPARACE PŘI GRADIENTOVÉ ELUCI

                Praktické aspekty a výhody gradientové eluce

                Určení času zpoždění gradientu

3 INSTRUMENTACE V HPLC

3.1         OBECNÉ SCHÉMA KAPALINOVÉHO CHROMATOGRAFU

3.2         TRANSPORT MOBILNÍ FÁZE

                Zásobníky mobilní fáze

                Odplynění mobilní fáze

                Vysokotlaká čerpadla současné HPLC instrumentace

                Oplach pístů HPLC čerpadel

                Ostatní typy vysokotlakých čerpadel

                Tvorba gradientu mobilní fáze

3.3         DÁVKOVÁNÍ VZORKU

                Vývoj metod pro dávkování vzorku

                Automatické dávkovače - autosamplery

                Nástřikové systémy s pevnou smyčkou

                Nástřikové systémy s průtočnou jehlou

                Konfigurace automatických dávkovačů pro dávkování vzorků

                Nádobky pro dávkování vzorků - vialky

3.4         CHROMATOGRAFICKÉ KOLONY PRO HPLC

                Konstrukce chromatografické kolony

                Charakteristika náplně chromatografické kolony

                Termostatování kolony a teplotní gradient

3.5         DETEKCE V HPLC

                Odezva detektoru

                Šum a drift

                Spektrofotometrické detektory

                Fluorescenční detektory

                Chemiluminiscenční detekce

                Refraktometrické detektory

                Elektrochemické detektory

                Vodivostní detektory

                Bezkontaktní vodivostní detektory

                Univerzální detektory na bázi aerosolu

                Hmotnostně spektrometrická detekce

3.6         DERIVATIZACE V HPLC

                Předkolonová derivatizace

                Postkolonová derivatizace

4 STACIONÁRNÍ FÁZE

4.1         PARAMETRY CHARAKTERIZUJÍCÍ STACIONÁRNÍ FÁZE

4.2         SILIKAGEL

4.3         CHEMICKY VÁZANÉ STACIONÁRNÍ FÁZE NA BÁZI SILIKAGELU

                Chemická stabilita silikagelových stacionárních fází

                Stacionární fáze s chemicky vázanými alkylovými řetězci

                Stacionární fáze modifikované aromatickými funkčními skupinami

                Fluorované stacionární fáze

                Chemicky vázané stacionární fáze s kombinovaným ligandem

                Diolová stacionární fáze

                Stacionární fáze s aminopropylovou a kyanopropylovou skupinou

                Problematika volných silanolových skupin

                Silikagelové stacionární fáze pro separace s vodnými mobilními fázemi

4.4         STACIONÁRNÍ FÁZE NA BÁZI OXIDŮ KOVŮ

                Oxid hlinitý

                Oxid zirkoničitý

4.5         STACIONÁRNÍ FÁZE NA BÁZI ORGANICKÝCH POLYMERŮ

4.6         STACIONÁRNÍ FÁZE PRO IONTOVĚ VÝMĚNNOU CHROMATOGRAFII

                Měniče aniontů - anexy

                Měniče kationtů - katexy

4.7         HYBRIDNÍ STACIONÁRNÍ FÁZE

                Hybridní stacionární fáze s ethylenovými můstky

                Hybridní stacionární fáze připravené povrchovou modifikací

                Hybridní stacionární fáze vícemodálního charakteru

4.8         STACIONÁRNÍ FÁZE NA BÁZI GRAFITOVÉHO UHLÍKU

4.9         VÍCEMODÁLNÍ STACIONÁRNÍ FÁZE

                Bimodální stacionární fáze

                Trimodální stacionární fáze

                Vícemodální stacionární fáze na bázi organického polymeru

                Hybridní vícemodální stacionární fáze

5 CHROMATOGRAFICKÉ SYSTÉMY

5.1         SYSTÉMY S NORMÁLNÍMI FÁZEMI (NP-HPLC)

                Princip retence v systémech s normálními fázemi

                Stacionární fáze pro chromatografii na normálních fázích

                Mobilní fáze a eluotropní řada

                Popis retence v systémech s normálními fázemi

                Využití chromatografie na normálních fázích

5.2         SYSTÉMY S REVERZNÍMI FÁZEMI (RP-HPLC)

                Princip retence v systémech s reverzními fázemi

                Stacionární fáze v systému reverzních fází

                Mobilní fáze v systému reverzních fází

                Popis retence v systémech s reverzními fázemi

                Ovlivnění retence v systémech s reverzními fázemi

                Bezvodý systém na reverzních fázích

                Využití chromatografie na reverzních fázích

5.3         IONTOVĚ VÝMĚNNÁ CHROMATOGRAFIE (IEC)

                Princip a popis retence v iontově výměnné chromatografii

                Stacionární fáze pro iontově výměnnou chromatografii

                Mobilní fáze v iontově výměnné chromatografii

                Využití iontově výměnné chromatografie

5.4         HYDROFILNÍ INTERAKČNÍ CHROMATOGRAFIE (HILIC)

                Princip retence v hydrofilní interakční chromatografii

                Stacionární fáze pro hydrofilní interakční chromatografii

                Mobilní fáze v hydrofilní interakční chromatografii

                Popis retence v hydrofilní interakční chromatografii

                Ovlivnění retence v hydrofilní interakční chromatografii

                Rozpouštědlo vzorku v hydrofilní interakční chromatografii

                Výhody a nevýhody metody hydrofilní interakční chromatografie

                Využití metody hydrofilní interakční chromatografie

5.5         HYDROFOBNÍ INTERAKČNÍ CHROMATOGRAFIE (HIC)

                Princip retence v hydrofobní interakční chromatografii

                Stacionární fáze pro hydrofobní interakční chromatografii

                Ovlivnění retence v hydrofobní interakční chromatografii

                Aplikace a problémy v hydrofobní interakční chromatografii

5.6         VÍCEMODÁLNÍ CHROMATOGRAFIE (MIXED-MODE CHROMATOGRAPHY)

                Princip separace a popis retence ve vícemodální chromatografii

                Stacionární a mobilní fáze ve vícemodální chromatografii

                Ovlivnění retence ve vícemodální chromatografii

                Výhody a aplikace vícemodální chromatografie

5.7         IONTOVĚ PÁROVÁ CHROMATOGRAFIE

                Princip retence s využitím iontově párové chromatografie

                Aplikace iontově párové chromatografie

5.8         MICELÁRNÍ KAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIE A MICELÁRNÍ ELEKTROKINETICKÁ CHROMATOGRAFIE

                Micelární kapalinová chromatografie

                Aplikace micelární kapalinové chromatografie

                Micelární elektrokinetická chromatografie

                Spojení MEKC s hmotnostní spektrometrií

                Využití MEKC

5.9         AFINITNÍ CHROMATOGRAFIE

                Princip retence v afinitní chromatografii

                Popis a ovlivnění retence v afinitní chromatografii

                Praktické provedení afinitní chromatografie

                Typy nosiče v afinitní chromatografii

                Ligandy

                Aplikace afinitní chromatografie

5.1         MOLEKULOVÁ VYLUČOVACÍ CHROMATOGRAFIE (SEC)

                Princip retence v molekulové vylučovací chromatografii

                Stacionární fáze v molekulové vylučovací chromatografii

                Mobilní fáze v molekulové vylučovací chromatografii

                Využití molekulové vylučovací chromatografie

5.11      CHIRÁLNÍ CHROMATOGRAFIE

                Separace enantiomerů

                Mechanismy chirální separace

                Typy chirálních stacionárních fází a jejich interakce

                Separační módy v chirální chromatografii

                Optimalizace chirální separace

                Polysacharidové chirální stacionární fáze

                Cyklodextrinové chirální stacionární fáze

                Makrocyklická antibiotika

                Chirální stacionární fáze na bázi cyklických polyetherů

                Glykoproteinové chirální stacionární fáze

                Chirální separace založené na ligandové výměně

                Aplikace chirální chromatografie

6 SOUČASNÉ TRENDY V KAPALINOVÉ CHROMATOGRAFII

6.1         ULTRA-VYSOKOÚČINNÁ KAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIE (UHPLC)

                Účinnost UHPLC separace

                Instrumentace v UHPLC

                Stacionární fáze pro UHPLC

                Přenos metody z HPLC na UHPLC

                Výhody a aplikace metody UHPLC

6.2         POVRCHOVĚ PORÉZNÍ ČÁSTICE

                Specifika povrchově porézních částic

                Účinnost povrchově porézních částic

                Stacionární fáze s povrchově porézními částicemi

                Výhody, nevýhody a aplikace povrchově porézních částic

6.3         MONOLITICKÉ KOLONY

                Anorganické monolity na bázi silikagelu

                Monolity na bázi organického polymeru

                Monolitické vícemodální fáze

6.4         VYSOKOÚČINNÁ KAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIE PŘI VYSOKÉ TEPLOTĚ (HTLC)

                Účinnost separace v HTLC

                Popis retence v HTLC

                Instrumentace v HTLC

                Výhody a využití HTLC

6.5         SUPERKRITICKÁ FLUIDNÍ CHROMATOGRAFIE

                Nadkritické tekutiny jako mobilní fáze

                Účinnost separace v superkritické fluidní chromatografii

                Instrumentace v superkritické fluidní chromatografii

                Stacionární fáze v superkritické fluidní chromatografii

                Spojení superkritické fluidní chromatografie s hmotnostní detekcí

                Využití metody SFC

6.6         DVOUROZMĚRNÁ KAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIE

                Koncept dvourozměrných separací

                Experimentální uspořádání 2D LC

                Vlastnosti vzorků a volba separačních systémů

                Gradientová eluce při úplné 2D LC analýze

                Zpracování a vyhodnocení dat

                Současné trendy v 2D LC

6.7         MINIATURIZACE V KAPALINOVÉ CHROMATOGRAFII

                Mikrokapalinová a nanokapalinová chromatografie

                Kapalinová chromatografie na čipu

                3D tisk v kapalinové chromatografii

                Kolony na bázi mikrosloupečků

 

7 SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY

 

Obsah II. Dílu

1 Praxe v moderní HPLC

1.1         Příprava a použití mobilní fáze

                Obecné zásady při přípravě mobilní fáze

                Filtrace mobilní fáze

                Odplynění mobilní fáze

                Pufrované mobilní fáze

1.2         Příprava a použití chromatografické kolony

                Obecné použití chromatografické kolony

                Instalace kolony a spojovacích kapilár

                Uchovávání chromatografické kolony

                Ekvilibrace kolony

                Použití předkolon a předkolonových filtrů

                Regenerace kolony

1.3         Pravidelná údržba kapalinového chromatografu

                Zařízení pro úpravu mobilní fáze

                Čerpadlo mobilní fáze

                Dávkovací zařízení

                Kolonový termostat

                Detektory

2             Vývoj a optimalizace HPLC metody

2.1         Analýza fyzikálně-chemických vlastností analytů a určení cíle metody

2.2         Výběr způsobu detekce analytů

                Detekční přístupy v HPLC

                Volba podmínek při UV detekci

                Volba podmínek při fluorescenční detekci

                Volba podmínek při detekci aerosolovými detektory

                Volba podmínek při elektrochemické detekci

                Volba podmínek při hmotnostní detekci

2.3         Volba chromatografického systému

                Nízkomolekulární látky

                Cukry

                Anorganické ionty

                Polymery

                Peptidy

                Proteiny

                Nukleové kyseliny

                Lipidy

2.4         Volba stacionární a mobilní fáze

                Stacionární fáze

                Rozměry kolony

                Velikost částic

                Velikost pórů částic

                Mobilní fáze a typ eluce

2.5         Předběžné experimenty s využitím standardních látek

                Obecné zásady volby výchozích podmínek a postupu optimalizace metody

                Systematický přístup k vývoji metody

2.6         Vlastní optimalizace metody

                Optimalizace pH mobilní fáze na reverzních fázích

                Optimalizace gradientového programu

                Objem vzorku dávkovaný na HPLC kolonu

                Průtok mobilní fáze

                Optimalizace teploty separace

                Výpočet a optimalizace doby analýzy

2.7         Řešení problémů separace při vývoji metody

2.8         Specifické optimalizační přístupy

                Sekvenční metody

                Simultánní metody

                Využití chromatografických optimalizačních programů pro vývoj metod

3             Příprava vzorků k chromatografické analýze

3.1         Základní techniky pro úpravu vzorků

                Přímá extrakce

                Srážení proteinů

                Extrakce z kapaliny do kapaliny

                Extrakce na tuhou fázi

3.2         Moderní trendy v technikách pro úpravu vzorků

                Mikroextrakční techniky

                On-line extrakční techniky

                Extrakční techniky s vysokou selektivitou

4             Vyhodnocování výsledků v HPLC

4.1         Kvalitativní hodnocení

4.2         Kvantitativní hodnocení

                Metoda vnějšího standardu

                Metoda přídavku standardu

                Metoda vnitřního standardu

                Metoda vnitřní normalizace

5             Validace metod v HPLC

5.1         Definice metrologických pojmů

5.2         Validační parametry

5.3         Praktické provedení validace

                Správnost metody (method accuracy)

                Přesnost metody (method precision)

                Linearita a rozsah metody

                Mez detekce a mez stanovitelnosti

                Selektivita metody

                Robustnost metody

5.4         Lékopisné nebo normované metody

5.5         Test způsobilosti chromatografického systému

6             Kvalifikace HPLC systému

6.1         Obecné podmínky chromatografických testů

6.2         Tlakový test systému

6.3         Teplota automatického dávkovače (správnost a linearita)

6.4         Teplota kolonového termostatu (správnost a linearita)

6.5         HPLC čerpadlo

                Správnost průtoku

                Opakovatelnost průtokové rychlosti

                Linearita průtokové rychlosti

                Správnost složení gradientu

                Přesnost míchání mobilních fází

                Linearita gradientu

6.6         HPLC automatický dávkovač (autosampler)

                Linearita a citlivost dávkovaného objemu

                Opakovatelnost dávkovaného objemu

                Detekce pozice vialky v zásobníku vialek

                Křížová kontaminace

6.7         HPLC detektory

                Linearita UV detektoru

                Správnost nastavení vlnové délky PDA detektoru

                Linearita fluorescenčního detektoru

                Správnost nastavení vlnové délky fluorescenčního detektoru

                Linearita RI detektoru

                Citlivost RI detektoru

                Opakovatelnost odezvy RI detektoru

7             Řešení problémů v HPLC (TROUBLESHOOTING)

7.1         Problémy systémového tlaku

                Vyšší systémový tlak než je obvyklé

                Nižší systémový tlak než je obvyklé

                Kolísající systémový tlak

7.2         Problémy základní linie

                Šum a drift základní linie

                Cyklický průběh základní linie

                Necyklický průběh základní linie

7.3         Problémy retenčního času

                Kolísavý retenční čas

                Zvyšující nebo snižující se retenční čas

                Změna retenčního času o novou hodnotu (konstantu)

7.4         Problémy tvaru a plochy píku

                Dvojitý pík

                Frontující pík

                Chvostující pík nebo deformovaný pík

                Negativní pík(y) (jeden nebo více)

                Uřezaný pík

                Snížení účinnosti separace

                Změna plochy píku

7.5         Problémy chromatogramu

                Více píků než očekáváme

                Méně píků než očekáváme

                Neobvyklý profil chromatogramu

8             Seznam použité literatury

9             Užitečné tabulky v HPLC denní praxi

9.1         Mísitelnost organických rozpouštědel používaných v HPLC

9.2         Dynamická viskozita h směsí acetonitril - voda a methanol – voda

9.3         Hodnoty absorpčních maxim a molárních extinkčních koeficientů typických funkčních skupin organických sloučenin